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【细胞治疗原创文章】病毒载体选择之下游工艺的差异及挑战


在上一期的文章中,我们初步探讨了不同病毒载体在上游工艺中的差异性,这些差异对于病毒载体的选择和生产成本均有不同程度的影响。那么,不同的病毒载体在下游工艺过程中是否也存在一定的差异性呢?这些差异性又会对CAR-T生产带来什么样的影响呢?


 从不同的工艺路线中可以看出,病毒载体在下游工艺中的差异性主要是下游处理过程中各个工艺单元的组合不同。同时,这些不同的工艺都需要面对相同的挑战,即病毒载体活性的维持、杂质的去除、病毒载体的回收率。我们不妨从这三个方面对不同的病毒载体在下游工艺中的差异和挑战进行简单的探讨。

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病毒载体的活性维持

       病毒载体在生产过程中会出现活性逐渐下降的情况。这个过程与病毒载体所处环境的理化状态密切相关。病毒载体所处的理化状态对于病毒载体活性的影响主要来自于温度、pH。不同缓冲液pH、不同储存温度,在不同条件下的病毒载体可以表现出不同的稳定性,这是由于不同病毒载体本身的结构不同导致的。更进一步的分析表明,病毒载体的稳定性与病毒载体生产用细胞所能提供的固醇类物质水平和细胞膜结构密切相关(Beer et al., 2003)。


 在另一项研究中发现,VSV-G包膜在稳定性上要优于GALV包膜(Carmo et al., 2006)。而VSV-G包膜常用于商业化的慢病毒载体,GALV包膜多应用于商业化的逆转录病毒载体,这也就意味着慢病毒载体在本身结构上要比逆转录病毒载体更稳定一些。因此,VSV-G包膜的慢病毒载体比GALV的逆转录病毒载体理论上可耐受更多步骤和更长时间的处理。


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杂质的去除

 病毒载体的下游工艺过程中需要去除的杂质种类较多。以慢病毒载体为例,杂质类型可分为产品相关杂质(例如:无感染性的病毒载体颗粒)和工艺相关杂质(例如:血清蛋白)(Ruscic et al., 2019)。这些杂质的去除主要基于病毒载体与杂质的颗粒大小、尺寸差异以及病毒载体与杂质带的电荷差异。常见的工艺单元为离心、膜过滤、核酸酶处理、分子筛层析、阴离子交换层析、切向流超滤等。基于上述工艺单元所建立的不同组合,可以将总DNA去除率控制在99.1%至99.84%,总蛋白去除率控制在99.85%至99.9%,宿主细胞DNA去除率控制在99.8%,宿主蛋白去除率控制在99.4%(Schweizer & Merten, 2010)。


慢病毒载体下游处理过程中,杂质含量随着工艺步骤的延伸而逐渐降低。其中,柱层析工艺是去除蛋白质杂质的主要步骤,过滤澄清和核酸酶处理是去除DNA的主要步骤,凝胶过滤是去除痕量杂质的主要步骤。

商业化的逆转录病毒载体下游处理工艺多以膜过滤、离心、核酸酶处理为主。这些处理步骤不包括柱层析和凝胶过滤,因此不能有效去除杂质(《基因转导与修饰系统药学研究与评价技术指导原则(征求意见稿)》)。为了弥补逆转录病毒载体在包膜上的劣势,通过采用VSV-G包膜和4070A 多嗜性包膜对逆转录病毒载体进行改造可以有效提高逆转录病毒载体的稳定性,进而可以采用经过优化的层析工艺进行柱层析处理(S. Coroadinha et al., 2010)。但上述研究目前还处于较早阶段,并未真正应用于商业化逆转录病毒载体的生产过程中,因此,商业化的慢病毒载体的整体质量控制水平要优于目前商业化的逆转录病毒载体。



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病毒载体的回收率

 病毒载体在下游工艺去除杂质的过程中,膜过滤的截留作用、pH的改变、盐离子强度的升高、剪切力等原因造成病毒载体活性的下降和病毒载体颗粒的丢失,两者都会带来病毒载体回收的挑战。在Mercedes Segura等人的研究中,对比了在相似工艺条件下,慢病毒载体和逆转录病毒载体之间的回收率差异。通过比较,Mercedes Segura等人发现,在相似工艺条件下,VSV-G包膜慢病毒载体回收率均比逆转录病毒载体要高。同时,由于病毒载体下游工艺步骤较多,即便每个步骤只有一点损失,最终也会导致回收率较低,因此,病毒载体整体下游工艺的回收率在30%左右也被认为是可以接受的。(Mercedes Segura et al., 2006)

 但是,逆转录病毒载体的回收率就一定低于慢病毒载体吗?答案是:不一定。

 科学家们认为,商业化的逆转录病毒载体所用的GALV包膜在下游工艺处理过程中不稳定会导致逆转录病毒载体的损失量高于慢病毒载体,因此,逆转录病毒通常被认为“不可纯化”(Boudeffa et al., 2019)。此时,商业化的逆转录病毒载体通常只会采用离心或膜过滤方法初步分离细胞碎片或宿主细胞等大尺寸杂质,由于工艺步骤的减少,实际的商业化逆转录病毒载体的回收率相对慢病毒载体要更高。

 综合上述几点,我们不难看出,由于慢病毒载体和逆转录病毒载体在使用的包膜稳定性上的差异,慢病毒载体的下游工艺可采用膜过滤、核酸酶处理、柱层析、超滤浓缩等多种工艺单元进行组合,而逆转录病毒载体的下游工艺多采用简单的离心或膜过滤的方法进行处理。由于慢病毒载体的下游工艺步骤复杂,回收率较低,导致工艺运行成本较高。逆转录病毒载体的下游工艺简单,各步骤回收率较高,因此工艺运行成本较低。虽然慢病毒载体的下游工艺回收率要低于逆转录病毒载体,但是慢病毒载体在下游处理过程中可以去除更多的杂质,因此纯度更好,安全性更高。随着资源的投入和技术的发展,逆转录病毒载体的柱层析工艺也正在研究过程中,相信随着时间的推移,逆转录病毒载体的回收率和质量水平也会有进一步提高。


Reference

1.       国家药品监督管理局审评中心《基因转导与修饰系统药学研究与评价技术指导原则(征求意见稿)》.pdf. (n.d.).

2.       Beer, C., Meyer, A., Müller, K., & Wirth, M. (2003). The temperature stability of mouse retroviruses depends on the cholesterol levels of viral lipid shell and cellular plasma membrane. In Virology (Vol. 308, Issue 1, pp. 137–146). https://doi.org/10.1016/S0042-6822(02)00087-9

3.       Boudeffa, D., Bertin, B., Biek, A., Mormin, M., Leseigneur, F., Galy, A., & Merten, O. W. (2019). Toward a scalable purification protocol of GaLV-TR-pseudotyped lentiviral vectors. Human Gene Therapy Methods, 30(5), 153–171. https://doi.org/10.1089/hgtb.2019.076

4.       Carmo, M., Faria, T. Q., Falk, H., Coroadinha, A. S., Teixeira, M., Merten, O. W., Gény-Fiamma, C., Alves, P. M., Danos, O., Panet, A., Carrondo, M. J. T., & Cruz, P. E. (2006). Relationship between retroviral vector membrane and vector stability. In Journal of General Virology (Vol. 87, Issue 5, pp. 1349–1356). https://doi.org/10.1099/vir.0.81302-0

5.       de las Mercedes Segura, M., Kamen, A., & Garnier, A. (2006). Downstream processing of oncoretroviral and lentiviral gene therapy vectors. Biotechnology Advances, 24(3), 321–337. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2005.12.001

6.       Merten, O. W., Hebben, M., & Bovolenta, C. (2016). Production of lentiviral vectors. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development, 3(December 2015), 16017. https://doi.org/10.1038/mtm.2016.17

7.       Ruscic, J., Perry, C., Mukhopadhyay, T., Takeuchi, Y., & Bracewell, D. G. (2019). Lentiviral Vector Purification Using Nanofiber Ion-Exchange Chromatography. In Molecular Therapy - Methods and Clinical Development (Vol. 15, pp. 52–62). https://doi.org/10.1016/j.omtm.2019.08.007

8.       S. Coroadinha, A., Gama-Norton, L., I. Amaral, A., Hauser, H., M. Alves, P., & E. Cruz, P. (2010). Production of Retroviral Vectors: Review. Current Gene Therapy, 10(6), 456–473. https://doi.org/10.2174/156652310793797739

9.       Schweizer, M., & Merten, O.-W. (2010). Large-Scale Production Means for the Manufacturing of Lentiviral Vectors. Current Gene Therapy, 10(6), 474–486. https://doi.org/10.2174/156652310793797748


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